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在核酸、蛋白濃度檢測過程中,230nm、260nm、280nm這幾個數值經常會出現,那這幾個數值代表什么?他們之間的最優關系又是什么呢?


230nm、260nm、280nm

230nm碳水化合物最高吸收峰的吸收波長,與A260的比值可進行核酸樣品純度評估。A230產生負值可能是由于在低核酸濃度的樣液中存在一些干擾成分。

260nm:核酸最高吸收峰的吸收波長,其吸收紫外光的性質是嘌呤環和嘧啶環的共軛雙鍵系統所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它們的物質,不論是核苷、核苷酸或核酸在260nm處都會一個最高吸收峰。

280nm:蛋白質由于含有芳香氨基酸,因此也能吸收紫外光,通常蛋白質的吸收高峰在280nm波長處。其與260nm處的吸光度比值,經常被用于判斷核酸樣品的純度。

除了這三個常見的波長外,在核酸檢測過程中340nm往往會被用來檢測樣品緩沖液的濁度和其他干擾因子。該值應該接近0.0,如果不是,表明溶液中有懸浮物。


吸光譜.jpg

圖1. 核酸、蛋白質吸光度譜


260/230、260/280

純度好的DNA或RNA,在pH7-8.5下:

A260 / A280比值應大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。

如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。

較純凈的核酸A260/A230的比值一般在1.8-2.2之間。

比值降低往往是樣品中存在一些污染物,如碳水化合物、鹽(胍鹽)等。

但實際樣品情況往往要相對復雜,如《分子克隆實驗指南》(第三版)所述,當 0.5%BSA蛋白質污染時,A260和A280的數值都下降,其結果是260/280的比值略微下降。但同時,蛋白殘留會導致A230的數值明顯上升,進而顯著影響260/230的比值。也就是說,如果樣品的260/280比值略低于標準值,但260 /230下降明顯,那么就應該考慮污染原因是蛋白殘留,而不是胍鹽殘留。

酚的最大吸收峰在270nm。酚的殘留會增加A230、A260和A280的數值,同時酚的吸收峰與核酸的吸收峰合并后,最大吸收峰會出現在270nm附近。因此當樣品最大吸收峰會出現在270nm附近,且260/280=1~1.5, 260/230=1~1.5,那么污染原因就應該考慮是酚殘留。

胍鹽會在小于230nm處產生大的吸收峰,進而顯著影響260/230比值,但胍鹽殘留不會影響A260、A280的數值,以及260/280的比值。也就是說,如果核酸樣品的260/280符合要求,但260/230<1,那么污染原因就應該考慮是胍鹽殘留。

吸光譜001.jpg

圖2. 純DNA和受污染DNA的吸光度譜


其他影響因素


樣品緩沖液pH值、離子濃度等


核酸的吸光值受pH值和緩沖液離子濃度影響,只有在一定的pH值和低離子濃度的條件下(如TE),才能得到精確的檢測結果。水由于pH值不穩定,可能會導致檢測誤差。此外一些緩沖液在紫外范圍內存在自身吸收,為了確保準確測量,請使用與懸浮或洗脫樣品時相同的緩沖液。


樣品濃度

由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,這些小顆粒的存在干擾測試效果,為了減少顆粒對檢測結果的影響,要求樣品吸光值至少大于0.1A,以減小顆粒的干擾。


操作因素

樣品混合要充分,否則容易出現樣品濃度重復檢測波動大;混合液不能存在氣泡,空白頁無懸浮液,否則讀數漂移劇烈;


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