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酶標儀工作原理

酶標儀實際上就是一臺變相的專用光電比色計或分光光度計。

是一種單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖。光源燈發出的光波經過濾光片或單色器變成一束單色光,進入塑料微孔極中的待測標本,該單色光一部分被標本吸收,另一部分則透過標本照射到光電檢測器上。光電檢測器將透射過待測標本后強弱不同的光信號轉換成相應的電信號,電信號經前置放大、對數放大、模數轉換等處理后,送入微處理器進行數據處理,轉換成相應的濃度,最后由顯示器和打印機輸出結果。


基本原理

即:酶聯免疫吸附劑測定原理:使抗原或抗體結合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體,這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開,最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后,底物被酶催化變為有色產物,產物的量與標本中受檢物質的量直接相關,故可根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高,故可極大地放大反應效果,從而單通道自動進樣的酶標儀工作原理圖 ,使測定方法達到很高的敏感度。


酶標儀分析原理 

酶標儀酶免疫分析是基于酶催化反應的特性來進行檢測和定量分析免疫反應。在實踐上,首先要讓酶標記的抗體或抗原與相應的配體(抗原或抗體)發生反應,然后再加入酶底物。酶催化反應發生后,可通過檢測下降的酶底物濃度或升高的酶催化產物濃度來達到檢測或定量分析抗原抗體反應的目的。 

 一、酶免疫分析的基本原理酶是一種能催化化學反應的特殊蛋白質,其催化效力超過目前所有的人造催化劑,一般可使反應加速108一1010倍。此外,酶還具有高度的專一性,即每一種酶只催化一種或一組密切相關的化學反應。EIA是將酶催化的放大作用與抗原、抗體的免疫反應相結合的一種微量分析技術。酶標記抗體或抗原后,既不影響抗體或抗原的免疫反應特異性,也不改變酶本身的催化活性,即在相應的反應底物參與下,標記的酶可以使底物基質水解而呈色,或使供氫體由無色的還原型轉變為有色的氧化型,這種有色產物可以通過肉眼、光學顯微鏡或電子顯微鏡進行觀察,也可以用分光光度計加以測定。呈色反應顯示了反應體系中酶,即被標記的抗體(或抗原)的存在,從而證明發生了相應的免疫學反應。因此,EIA是一種特異而敏感的檢測技術,可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位,也可以在微克、甚至納克水平上對其進行半定量、定量測定。 


 二、酶免疫分析方法中的主要組成部分

(一)固相載體非均相EIA免疫實驗所用的固相載體應具備以下條件:

①可結合抗體(抗原)的容量大、種類多;

②可將抗體(抗原)牢固地固定在其表面,雖經長期保存和多次洗滌也不脫落;

③不影響所固定抗體(抗原)的免疫反應性;

④抗體的Fc段(或抗原)被固定在載體上時其與抗原(抗體)的結合空間位點應朝向反應液。常用的材料有:1.塑料如由聚苯乙烯或聚氯乙烯制成的微孔反應板(48孔、96孔)或小珠、小試管等產品,是目前應用最廣、最普及的一種固相載體,主要通過非共價鍵吸附抗原或抗體。該類載體的應用可以簡化整個EIA的操作步驟,使之易于實現自動化。

2、可磁化顆?;颦傊侵檫@類固相載體通過共價鍵結合抗原或抗體,在檢測中可分散到整個反應混合液中,有很大的表面積,結合容量較大,因此結合較為有效,使免疫反應得以迅速進行;但制備固相抗體有較嚴格的技術要求。

(二)包被蛋白經過純化后,大部分抗原、抗體都可作為ELA反應的包被蛋白??乖蚩贵w的濃度高,吸附在載體表面的也越多。

(三)待測樣品EIA中的待測樣品可以為細胞、血清、腦脊液、胸腹水及其他體液中的任何抗原、抗體,某些反應,如間接法檢測丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)、競爭抑制法檢測乙型病毒性肝炎核心區外型抗體(抗-HBcIgG)等需要對待測樣品進行稀釋后再進行分析

(四)酶標記物酶標記物是指將酶通過某些化學物(交聯劑)和抗原、抗體、Fab片段等蛋白結合在一起的復合物,利用該復合物可以檢測相對應的免疫反應原性蛋白。目前常用的交聯劑有:戊二醛、氟二硝基苯、過碘酸鈉等。

(五)各種緩沖液如:包被液、封閉液、稀釋液、洗液、顯色底物和緩沖液、終止液等。


酶標儀的工作原理及結構

由酶聯免疫吸附實驗法可知,酶標儀應該用比色法來分析抗原或抗體的含量,即它應依照比色原理進行工作。實際上,酶標儀就是一臺變相的光電比色計或分光光度計,其基本工作原理與主要結構和光電比色計幾乎相同。圖1是一種單通道、自動進樣的酶標儀的工作原理圖。 

 

圖1 酶標檢測儀工作原理圖 

 

光源燈發出的光線經過濾光片或單色器后,成為一束單色光束。該單色光束經過塑料微孔板中的待測標本,被標本吸收掉一部分后,到達光電檢測器。光電檢測器將投射到其上面的光信號的強弱變成電信號的大小。此電信號經前置放大、對數放大、模數轉換等模擬信號處理后,送入微處理器進行數據處理和計算。最后由顯示器和打印機將測試結果顯示、打印出來。 

微處理機還通過控制電路來控制X、Y方向的機械驅動機構的運動。但對于非自動型的酶標儀,它是用手工來移動微孔板的,可以省去X、Y方向的機械驅動機構及其電路,這樣的儀器體積更小,結構也更簡單。 

微孔板是一種用來盛裝待測樣本的透明塑料板,板上有多排小孔,如有40孔板、55孔板和96孔板等多種規格。每個小孔可以盛放零點幾毫升的溶液。根據儀器的不同,既可以一個孔一個孔地檢測,也可以一排孔一排孔地檢測。 

酶標儀既可以使用和分光光度計相同的單色器,也可以使用干涉濾光片來獲得單色光。和光電比色計一樣,使用濾光片作過濾裝置時,將濾光片設計到微孔板的前面和后面效果是一樣的。 

圖2是一種酶標儀的光路系統。光源燈發出的光,經過聚光鏡、光闌后,到達反射鏡,經反射鏡作90o反射后,垂直通過比色液,然后再經濾光片到達光電管。 

 

圖2 一種酶標儀光路系統 

 

一般酶標儀的光束既可以設計成從上到下通過比色液,也可以設計成從下到上通過比色。 

由酶標儀的工作原理方框圖和光路圖可以看出,它和普通光電比色計的不同之處在于:一是盛裝比色液的容器不是使用比色皿,而是使用了塑料微孔板,塑料微孔板常用透明的聚乙烯材料制作,之所以采用塑料微孔板來作固相載體,是利用它對抗原或抗體有較強的吸附這一特點;二是酶標儀的光束是垂直通過待測液的;三是酶標儀通常不使用A而是使用光密度OD來表示吸光度。 

酶標儀有單通道和多通道兩種類型,單通道又分為自動型和手動型兩種。其中,自動型的儀器設有X和Y兩個方向的驅動機構,在機械裝置的驅動下,微孔板上的小孔一個個依次進入光束下面測試。手動型靠手移動微孔板來進行測量。 

在單通道酶標儀的基礎上,又發展了多通道、全自動型酶標儀。多通道酶標儀一般都是自動型的,它設有多個光束和多個光電檢測器。如8通道的儀器,設有8條光束(或8個光源)、8個檢測器和8個放大器。在機械驅動裝置的作用下,樣品被8個一排、8個一排檢測。多通道酶標儀的檢測速度快,但其結構比較復雜,價格也較貴,多用于大中型醫院。 

酶標儀的其他部分的結構,與光電比色計和小型生化分析儀基本相同


窗體頂端

酶標儀的檢測原理

光是電磁波,波長100nm~400nm稱為紫外光, 400nm~780nm之間的光可被人眼觀察到,大子780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩,是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色,是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下,檢測被測物的吸光值。 

  檢測單位:

  光通過被檢測物,前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。

  檢測單位用OD值表示,OD是optical delnsity(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度,OD=1og(1/trans),其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則,OD值與光強度成下述關系:

E=OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度,Ι0為在檢測物之前的光強度,Ι為從被檢測物出來的光強度。

  OD值由下述公式計算:

  E=OD=C×D×E

  C為檢測物的濃度

  D為檢測物的厚度

  E為摩爾因子

  在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長,在此波長下,此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段,就會造成檢測結果的不準確。因此,在測定檢測物時,我們選擇特定的波長進行檢測,稱為測量波

長。

  但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收,為了消除這種非特異性吸收,我們再選取一個參照波長,以消除這個不準確性。在參照波長下,檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。

  Anthos 酶標儀檢測值計算

  儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量,轉換成二進位數字信號,最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為0%,沒有檢測物的透光值為100%。則實際檢測中,檢測物的透光值均在 0%一100%之間。

       透光值的計算如下:

  T=(Meas—Min)/(Max—Min)

  其中T為透光值, Meas為檢測的二進位數值,Min為在 0%的情況下檢測的二進位數值,Max為在100%的情況下檢測的二進位數值,舉例如下:

  MaX=3600 Mn=20 Meas=30

  T=(30-20)/3600-20)=0.0028

  OD=1og(1/T)=1og(1/0.0028)=2.552

  Anthos 酶標儀的中心定位

  儀器會自動對酶標孔進行中心定位,中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時,儀器其實要進行35個點的測量,選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。 

  光源的參照通道

  參照通道是用來校準由于電壓不穩或燈泡磨損帶來的影響。

  酶標儀的用途和其它提示

  用于ELISA試劑的測定,廣泛用于各種實驗室,包括臨床實驗室。

  質量控制

  質量控制是試劑檢測的重要因素。請按照試劑說明書的要求進行質量控制。

  空白校正

  有一些試劑盒的說陰書將空白孔設置為空氣,其它大多數空白孔的設置是用試劑來設置的,請按照試劑盒的說明書要求進行。

  檢測結果的解釋

  由于有相當多的因素會影響檢測的結果,如不同的酶標板,檢測試劑的體積,都會造成OD值的不同,因此,只有使用同一酶標板反應的試劑檢測結果才能比較和分析。對結果的臨床解釋請依照試劑盒的說明書進行。

窗體底端


酶標儀的檢測原理 

光是電磁波,波長100nm~400nm稱為紫外光,400nm~780nm之間的光可被人眼觀察到,大子780nm稱為紅外光。人們只所以能夠看到色彩,是因為光照射到物體上被物體反射回來。綠色植物之所以是綠色,是因為植物吸收了光中的紅色光譜。酶標儀測定的原理是在特定波長下,檢測被測物的吸光值。    檢測單位:  

  光通過被檢測物,前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量,特定波長下,同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。  

  檢測單位用OD值表示,OD是optical delnsity(光密度)的縮寫,表示被檢測物吸收掉的光密度,OD=1og(1/trans),其中trans為檢測物的透光值。根據Bouger-amberT-beer法則,OD值與光強度成下述關系:  

    E=OD=logΙ0/Ι其中E表示被吸收的光密度,Ι0為在檢測物之前的光強度,Ι為從被檢測物出來的光強度。

    OD值由下述公式計算:E=OD=C×D×E  C為檢測物的濃度 D為檢測物的厚度 E為摩爾因子  

  在特定波長下測定每一種物質都有其特定的波長,在此波長下,此物質能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長段,就會造成檢測結果的不準確。因此,在測定檢測物時,我們選擇特定的波長進行檢測,稱為測量波長。  

  但是每一種物質對光能量還存在一定的非特異性吸收,為了消除這種非特異性吸收,我們再選取一個參照波長,以消除這個不準確性。在參照波長下,檢測物光的吸收最小。檢測波長和參照波長的吸光值之差可以消除非特異性吸收。    Anthos 酶標儀檢測值計算  

  儀器中的檢測器接收透過被檢測物的光能量,轉換成二進位數字信號,最大為4095。儀器定義沒有光源下的透光值為 0%,沒有檢測物的透光值為100%。則實際檢測中,檢測物的透光值均在 0%一100%之間。透光值的計算如下:  

  T=(Meas—Min)/(Max—Min)  

  其中T為透光值, Meas為檢測的二進位數值, Min為在 0%的情況下檢測的二進位數值, Max為在100%的情況下檢測的二進位數值,舉例如下:MaX=3600 Mn=20 Meas=30   T=(30-20)/3600-20)=0.0028   OD=1og(1/T)=1og(1/0.0028)=2.552   Anthos 酶標儀的中心定位  

  儀器會自動對酶標孔進行中心定位,中心定位是要消除酶標孔底的凸凹引起的厚薄不均帶來檢測的不準確。在對每一個酶標儀進行檢測時,儀器其實要進行35個點的測量,選取最中間的5個點的均值為本孔的OD值。  

  光源的參照通道  

  參照通道是用來校準由于電壓不穩或燈泡磨損帶來的影響。 酶標儀的用途和其它提示  

  用于ELISA試劑的測定,廣泛用于各種實驗室,包括臨床實驗室。 質量控制

  質量控制是試劑檢測的重要因素。請按照試劑說明書的要求進行質量控制。 空白校正


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